操作條件對于色譜分離有很大影響。
柱長，柱內徑：一般講，柱管增長，可改善分離能力，短則組分餾出的快些；柱內徑小分離效果好，柱內徑大處理量大，但柱內徑過大，將導致擔體不能均勻地分布在色譜柱中。分析用柱管一般內徑為3-6毫米，柱長為1-4米。
柱溫：是一個重要的操作變數，直接影響分離效能和分析速度。選擇柱溫的根據是混合物的沸點范圍，固定液的配比和鑒定器的靈敏度。提高柱溫可縮短分析時間；降低柱溫可使色譜柱選擇性增大，有利于組分的分離和色譜柱穩定性提高，柱壽命延長。一般采用等于或高于數十度于樣品的平均沸點的柱溫為較合適，對易揮發樣用低柱溫，不易揮發的樣品采用高柱溫。
載氣流速：載氣流速是決定色譜分離的重要原因之一。一般講流速高色譜峰狹，反之則寬些，但流速過高或過低對分離都有不利的影響。流速要求要平穩，常用的流速范圍每分鐘在10-100亳升之間。
固定相：固定相是由固體吸附劑或涂有固定液的擔體構成。
(1)固體吸附劑或擔體粗細：一般采用40-60目、60-80目、80-100目。當用同等長度的柱子，顆粒細的分離效率就要比粗的好些。
(2)固定液含量：固定液含量對分離效率的影響很大，它與擔體的重量比一般用15%-25%。比例過大有損于分離，比例過小會使色譜峰拖尾。
進樣：一般講進樣快，進樣量小，進樣溫度高其分離效果好。對進液體樣，速度要快，汽化溫度要高于樣品中高沸點組分的沸點值，一次汽化，保證色譜峰形不致展寬、使柱效高。當進樣量在一定限度時，色譜峰的半峰寬是不變的。若進樣量過多就會造成色譜柱超載。一般講柱長增加四倍，樣品的許可量增加一倍。對于常規分析，液體進樣量為1-20微升；氣體進樣量為0.1-5毫升。
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